Evaluation de l’activité apoptotique de l’extrait méthanolique de Withania coagulans contre le cancer du sein humain et les lignées de cellules Vero ( utilisées pour culture cellulaire)
Résumé
Contexte
Le genre Withania (famille: Solanaceae) occupe une place importante dans l’Ayurveda, le système de médecine traditionnel indien. Withania somnifera Dunal et Withania coagulans Dunal ont été documentés dans la tradition, comme des panacées pour diverses affections depuis des temps immémoriaux. W. coagulans (WC), communément appelé fromager indien, est utilisé pour la fermentation du lait destiné à la production de fromage dans diverses régions de l’Inde.
Objectifs
Dans l’étude, la cytotoxicité in vitro de l’extrait méthanolique de fruits secs (baies) de WC a été évaluée en fonction de la dose en utilisant la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan contre la lignée cellulaire du cancer du sein humain MDA-MB-231 et la lignée cellulaire rénale épithéliale normale Vero la gamme 20-200 μg / ml.
matériel et méthodes
Le pourcentage de viabilité des lignées cellulaires a été déterminé en utilisant un dosage au MTT et une cytométrie.
Résultats
L’extrait méthanolique de WC a montré une activité anticancéreuse significative contre la lignée cellulaire MDA-MB-231. La viabilité cellulaire a été réduite à environ 50% à 40 µg / ml d’extrait méthanolique dans 50% de DMSO. La cytotoxicité de l’extrait était inférieure dans 10% et 1% de DMSO. D’autre part, l’extrait méthanolique de WC n’a présenté aucune activité significative in vitro contre les cellules Vero à 170 et 200 µg / ml. L’âge de l’ADN isolé à partir de cellules cancéreuses traitées révélait une fragmentation caractéristique, caractéristique de l’apoptose. Le profilage HPLC a été réalisé pour l’identification des composants actifs, ce qui a démontré la présence de Withaferin A dans l’extrait méthanolique.
Conclusion
L’extrait méthanolique de WC possède une activité apoptotique in vitro sur les cellules cancéreuses du sein humain, même s’il est inférieur à celui de W. somnifera et mérite une enquête plus approfondie.
Mots clés
Anticancéreux
Cytotoxicité
MDA-MB-231
Vero
Withania coagulans
1. Introduction
Les médicaments dérivés de produits naturels ont suscité un intérêt et une attention généralisés dans le monde entier en raison de leur innocuité, de leur efficacité et de leurs effets secondaires relativement moins importants. Cela a provoqué un changement de paradigme en faveur de l’adoption de remèdes à base de plantes plus sûrs. La plante, Withania coagulans Dunal, est bien documentée dans l’Ayurveda en tant que traitement curatif d’une multitude de maladies et de conditions [1]. Les fruits et les feuilles de W. coagulans Dunal (Fig. 1) contiennent une enzyme appelée Withanin et sont couramment utilisés pour la coagulation du lait [1], [2].
Fig. 1
Fig. 1. (a). Withania coagulans (L.) Dunal Habit (b) Fruits (avec l’aimable autorisation de Gupta, 2012).
Différentes parties de cette plante sont connues pour posséder et présenter un large spectre d’activités biologiques [1]. Le fruit est une baie au goût sucré, aux propriétés sédatives, émétiques et diurétiques [2]. L’arbuste est largement répandu en Inde et se rencontre dans les régions du Pendjab, du Rajasthan, de Simla, du Kumaun et du Garhwal [1]. Les fruits secs sont couramment utilisés pour le traitement et la gestion du diabète dans le nord de l’Inde [1]. Pas étonnant, le fruit est aussi communément appelé ‘tukhm-e-hayat’ (fruit de la vie). L’usine possède également une gamme d’activités, à savoir: hypoglycémique [3], [4], hypolipidémique, piégeant les radicaux libres, cardiovasculaire, propriétés hépatoprotectrices, anti-inflammatoires, cicatrisantes, antitumorales, immuno-suppressives, cytotoxiques, antifongiques et antibactériennes [1].
Les composants chimiques les plus actifs du genre Withania sont les withanolides, qui sont des agents anticancéreux connus, ainsi que des flavonoïdes [2]. Le mécanisme détaillé sous-jacent à l’effet anticancéreux de la WC est encore largement inconnu. L’activité anti-mutagène d’extraits de fruits de WC a été évaluée dans des cellules de moelle osseuse de souris. Les résultats ont montré qu’un seul i.p. une dose de 500-1500 mg / kg de poids corporel d’extrait de fruit de WC avant 24 h a considérablement réduit la formation de micronoyaux dans les cellules de la moelle osseuse de souris par rapport au groupe cyclophosphamide [5].
La Withaferine A, le Withanolide A et le Withanone sont les principaux withanolides présents dans le genre Withania [6], [7], parmi lesquels la Withaferin A est la plus importante en termes de concentration et de spectre d’activité [1]. Il possède une activité antibiotique significative et son effet anti-tumoral a été étudié contre les cellules malignes du rhinopharynx (KB) in vitro [1]. Il interfère dans la division cellulaire en arrêtant la mitose à la métaphase. Des études in vivo ont également mis en évidence les effets inhibiteurs de la croissance et radio-sensibilisants de la Withaférine A sur le carcinome d’ascite d’Ehrlich chez la souris [8], [9]. Il a également été trouvé pour arrêter la division cellulaire dans des cellules de fibroblastes de poulet embryonnaires. Des activités anticancéreuses et apoptotiques d’extraits de fruits aqueux et méthanoliques de WC ont également été étudiées sur la papillomagenèse cutanée induite par le DMBA in vivo [5] ainsi que in vitro [10], [11]. Dans la présente étude, l’activité apoptotique de WC a été testée contre le cancer du sein humain ainsi que pour les lignées de cellules épithéliales normales. Les résultats ont révélé que l’extrait méthanolique de fruits possède une activité significative contre la lignée cellulaire du cancer du sein mais aucune activité appréciable contre la lignée cellulaire normale. Le genre Withania peut, en tant que tel, être utilisé en tant que médicament d’appoint ou complémentaire chez les patients subissant un traitement agressif en milieu clinique contre un certain nombre de maladies chroniques et débilitantes comme le cancer.
- Matériels et méthodes2.1. RéactifsDu PBS (pH = 7,2, 1x), de la trypsine – EDTA à 0,25%, du milieu DMEM / F-12 de Eagle modifié par Dulbecco, du bleu trypan à 0,4% et une solution antibiotique / antimycosique (100 ×) ont été obtenus auprès de Gibco, Technologies de la vie; alors que le sérum de veau fœtal (FBS) et le MTT ont été obtenus auprès de Himedia. La solution d’hydrochlorure de doxorubicine a été obtenue auprès de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA) et de diméthylsulfoxyde (DMSO) auprès de Calbiochem. Le standard Withaferin A provenait de Natural Remedies Ltd. Veerasandra, Bangalore-100. Tous les réactifs de qualité HPLC ont été utilisés en HPLC. Tous les autres produits chimiques étaient de qualité analytique.2.2. Collection de matériel végétalLa plante WC a été identifiée par un botaniste compétent de l’Institut national de recherche botanique (NBRI) de Lucknow. Les fruits secs de W. coagulans ont été achetés sur le marché local de Lucknow, en Inde, et ont été séchés à l’ombre, puis broyés.2.3. La préparation des échantillons
Toutes les procédures ont été effectuées conformément à notre étude précédente rapportant l’activité cytotoxique d’extraits méthanoliques et éthanoliques de Withania somnifera [12]. En résumé, un extrait méthanolique à 50% a été préparé en extrayant trois fois 25 g de poudre de baies de WC. Les trois extraits ont été réunis et filtrés sur du papier filtre Whatman N ° 1 (125 mm) et concentrés dans un bain d’eau jusqu’à la formation d’une pâte semi-solide. La pâte a été séchée dans un dessiccateur jusqu’à l’obtention d’une poudre et conservée dans un récipient hermétique jusqu’à son utilisation ultérieure. Pour comparer une meilleure dissolution et une meilleure activité, 20 mg / ml de chacun de l’extrait en poudre ont été dissous dans du DMSO à 1%, 10% et 50%. Tous les extraits ont été filtrés à travers des unités de filtration pour seringues stériles (0,22 um, Millipore, Fisher Scientific) avant addition au milieu de culture cellulaire.
2.4. Évaluation biologique
2.4.1. Lignées cellulaires
Deux lignées cellulaires à savoir. MDA-MB-231 (cancer du sein humain) et Vero (cellules épithéliales de rein de singe vert d’Afrique, ATCCCCL-81) ont été obtenus du National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Inde, et ont été conservés comme tels. Laboratoire de culture de tissus et de cellules, Collège médical de Lucknow de l’Ère, Lucknow, conformément au protocole précédemment établi [12].
2.5. Culture de cellules
Pour les expériences, les cellules ont été traitées à la trypsine et ensemencées à une densité de 0,5 x 105 cellules / puits pendant 24 h dans des plaques à 6 puits (Linbro, MP Biomedicals) aux fins d’adhérence. Les cellules ont été exposées à 20-200 µg / ml d’extrait méthanolique de WC dans du DMSO pendant les 48 heures suivantes. Des témoins appropriés non traités ont également été inclus. Toutes les expériences ont été effectuées en triple. Les résultats ont été tracés sous forme de graphique de la viabilité cellulaire en fonction de la période.
2.6 Étude morphologique
Les cellules ont été observées et photographiées pour les caractéristiques morphologiques au microscope à contraste de phase (Nikon Eclipse Ti, Japon).
2.7 Essais de cytotoxicité
2.7.1. Essai d’exclusion de colorant bleu trypan
Le test a été effectué comme indiqué précédemment [12].
2.7.2. (Test méthyltétrazolium-MTT) Détermination du nombre de cellules optimal pour le test
Pour la standardisation, des dilutions en série de la lignée cellulaire MDA-MB-231 ont été effectuées / 100 µl dans des plaques de culture tissulaire pour microtitration à 96 puits (Linbro, MP Biomedicals). Le MTT a été réalisé conformément au protocole publié [12]. Les valeurs d’absorbance ont été enregistrées sur un lecteur de plaque Biorad PW41 ELISA à 550 nm avec une longueur d’onde de référence de 630 nm et interprétées comme un nombre de cellules en fonction du graphique d’absorbance.
2.7.3. Evaluation de la cytotoxicité et de la viabilité cellulaire
Les puits traités et les contrôles ont été soumis à un test MTT par dilution appropriée, de sorte que la concentration finale de DMSO dans chaque puits était <0,5% (v / v). En bref, les cellules MDA ont été ensemencées à une fréquence de 16 000/100 µl dans des plaques de culture tissulaire à microtitration à 96 puits pendant 24 h, puis après addition de l’extrait de WC (20 à 200 µg / ml dans du DMSO à 1%, 10% et 50%). ), pendant encore 48 h. Les puits contenant du milieu ont uniquement servi de blancs. Le chlorhydrate de doxorubicine a été utilisé comme contrôle positif. Des cellules dans un véhicule contenant du milieu (DMSO à 1%, 10% et 50%) ont servi de témoins. Les résultats ont été interprétés comme un pourcentage de viabilité cellulaire obtenu en traçant l’absorbance par rapport à la concentration de l’extrait en μg / ml. Le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé comme suit: = {(AT-AB) / (AC-AB)} × 100 où,
AT = Absorbance du traitement bien
AB = Absorbance du blanc
Ac = Absorbance du puits témoin
% d’inhibition cellulaire = 100 – Survie cellulaire
Les valeurs de CI50 des extraits ont été déterminées à partir de la courbe, en tant que concentration réduisant de 50% la viabilité cellulaire.
2.7.4. Comparaison de l’activité cytotoxique des extraits
L’effet dépendant de la dose de l’extrait de fruit de WC sur les cellules cancéreuses du sein humain a été comparé à celui des cellules épithéliales normales (Vero) en utilisant le test au MTT décrit ci-dessus. En bref, des cellules Vero ont été ensemencées (14 000/100 µl) dans des plaques de puits de culture tissulaire à microtitration à 96 puits pendant 24 h, puis traitées avec un extrait de WC à deux concentrations (170 et 200 µg / ml), cytotoxiques pour les cellules cancéreuses. , pour les prochaines 48 heures suivies par le test MTT. Les résultats ont été observés, enregistrés et interprétés comme indiqué ci-dessus.
2.8. Analyse HPLC
2.8.1. Préparation de la norme pour l’analyse HPLC
Le standard Withaferin-A a été dissous dans du méthanol de qualité HPLC (10 mg / 50 ml) et dilué 50 fois dans du méthanol. La linéarité a été observée pour le dosage de Withaferin-A dans la plage de 0,2 à 20 µg / ml.
2.8.2. La préparation des échantillons
L’extrait de WC a été préparé à une concentration de 1,0 mg / ml dans 0,5% de DMSO de qualité HPLC et dilué 50 fois dans du méthanol de qualité HPLC. Les solutions d’échantillon et de Withaferin-A ont été filtrées à travers des filtres Millipore stériles de 0,45 µm avant l’injection. Le volume d’injection était de 10 µl pour l’étalon et pour l’échantillon.
2.8.3. Procédure
La HPLC a été réalisée sur un système HPLC Waters Alliance 515, équipé de deux pompes Waters 515, d’un module de commande de pompe Waters, d’un dégazeur, d’un injecteur et d’un détecteur à réseau de photodiodes Waters 2998 (Waters, Milford, MA, USA), comme indiqué précédemment [12]. . Pour les séparations, l’élution par gradient de la phase mobile a été appliquée pendant 55 minutes, comme indiqué précédemment [12].
2.9 Isolement de l’ADN à partir de cellules traitées et de cellules témoins
A la fin du traitement (48 h), les cellules adhérentes ont été traitées à la trypsine, regroupées avec des cellules mortes en suspension, centrifugées et finalement mises en suspension dans du PBS. L’ADN a été isolé en utilisant le kit NucleoSpin Blood (Macheray-Nagel, Allemagne).
2.10. Essai de fragmentation de l’ADN
Une électrophorèse sur gel d’agarose (AGE) d’ADN isolé provenant de cellules traitées a été réalisée sur un gel à 1,5% à 60 V pendant 90 min en utilisant un tampon 1x TBE dans une unité d’électrophorèse Genei (Bengaluru, Inde). Les gels ont été colorés au bromure d’éthidium et l’ADN a été visualisé dans un système de documentation sur gel (Biorad, USA).
2.11. Interprétation des données et analyse statistique
Des valeurs d’absorbance inférieures aux témoins indiquent une réduction du taux de prolifération cellulaire dans le test au MTT. Inversement, une absorbance plus élevée correspond à une prolifération cellulaire accrue. L’analyse morphologique a permis de déduire des preuves de la mort cellulaire, les cellules mortes se présentant sous forme de cellules flottantes et arrondies, par rapport aux cellules vivantes adhérentes en forme de fuseau. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± ET des expériences effectuées en triple.
- Résultats3.1. L’extrait méthanolique de WC a montré une cytotoxicité contre les cellules cancéreuses du sein humain avec moins d’effet sur les cellules normalesIl a été constaté que l’extrait méthanolique de WC dans du DMSO à 50% était le plus efficace pour provoquer une cytotoxicité dans les cellules MDA (valeur de CI50 d’environ 40 μg / ml) par rapport aux extraits de WC dans du DMSO à 1% et à 10%. La figure 2 décrit l’effet dépendant de la dose de l’extrait méthanolique de WC dans du DMSO à 1%, 10% et 50% sur des cellules MDA à l’aide du test MTT.
Fig. 2. Effet dose-dépendant de l’extrait méthanolique de WC dans du DMSO à 1% (a), 10% (b) et 50% (c) sur la viabilité des cellules MDA in vitro. La concentration finale de DMSO dans chaque puits ne dépassait pas 0,5% (v / v).
La figure 3 décrit l’analyse morphologique des cellules non traitées par rapport aux cellules traitées par rapport à l’extrait méthanolique de WC (20 à 200 µg / ml). Les chiffres montrent clairement que le WC a montré un effet cytotoxique ainsi que cytostatique sur les cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 chez l’homme à des concentrations plus élevées (> 60 µg / ml). L’extrait méthanolique avait une CI50 de 120 et 51 µg / ml dans du DMSO à 1% et 10%, respectivement, comparé à 40 µg / ml dans du DMSO à 50%. Les cellules traitées présentaient une morphologie modifiée au microscope inversé.
Fig. 3. (a – e) Contrôles montrant des cellules cancéreuses du sein humain MDA non traitées dans du DMSO à 50% et (f – j) l’activité cytotoxique de l’extrait méthanolique de WC à 20, 60, 100, 170 et 200 µg / ml, respectivement. dans 50% de DMSO après 48 h (grossissement 10 ×). La concentration finale de DMSO dans chaque puits ne dépassait pas 0,5% (v / v).
L’extrait méthanolique n’a pas montré d’activité significative lorsque 1% de DMSO a été utilisé comme véhicule. 50% de DMSO s’est avéré être un meilleur véhicule pour la dissolution de l’extrait de WC par rapport à 1% et 10% de DMSO. Le DMSO à des concentrations de 0,25% ou de 0,5% n’a pas d’effet cytotoxique en soi (Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5). La doxorubicine a présenté une inhibition cytotoxique et dose-dépendante de la prolifération cellulaire et la valeur IC50 de la doxorubicine contre les cellules MDA-MB-231 a été déterminée à 0,50 ± 0,03 µM (Fig. 4).
Fig. 4. (a) Contrôle montrant des cellules cancéreuses du sein humain MDA non traitées en présence de 0,5% de DMSO et (b) Activité cytotoxique du chlorure de doxorubicine à 0,5 µM dans du DMSO à 0,5% après 48 h (grossissement 10 ×).
Fig. 5. (a – b) Contrôles montrant des cellules épithéliales de rein humain Vero non traitées dans du DMSO à 50% (c – d) Effet de l’extrait méthanolique de WC à 170 et 200 μg / ml respectivement dans du DMSO à 50% après 48 h (grossissement 10 × ). La concentration finale de DMSO dans chaque puits ne dépassait pas 0,5% (v / v).
L’effet de l’extrait méthanolique de WC a également été testé sur des cellules Vero, une lignée de cellules épithéliales de rein de singe vert d’Afrique (figure 5). L’extrait n’a montré aucun effet cytotoxique significatif sur la lignée cellulaire normale à des concentrations cytotoxiques pour les cellules de cancer du sein humain (170 et 200 µg / ml) (Fig. 3).
La caractérisation phytochimique qualitative des constituants de l’extrait a été réalisée par HPLC (Fig. 6a, b). De la Withaférine-A a été détectée dans l’extrait (Rt = 24,9 min), bien qu’en faible quantité, ce qui explique la faible activité de l’extrait de WC par rapport à l’extrait méthanolique de W. somnifera (WS), comme indiqué précédemment [12]. La méthode HPLC analytique utilisée dans l’étude a fourni une bonne résolution de base des pics de withanolides présents dans les extraits de WS par rapport à la norme Withaferin-A (Rt = 24,9 min). L’ADN isolé de cellules traitées au WC a montré une formation typique d’échelle d’ADN sur l’AGE (Fig. 7), corroborant encore le fait que l’extrait méthanolique de WC induit l’apoptose dans les cellules cancéreuses du sein [13].
Fig. 6. (a) Profil HPLC du standard de travail Withaferin-A. Withaferin-A, (Rt = 24,943 min) (b) du profil de CLHP de l’extrait méthanolique de fruits WC dans des conditions identiques. Avec la chaférine-A, (Rt = 24,934 min).
(Rt = 24.934 min).
Fig. 7. Essai de fragmentation de l’ADN pour la détection de l’apoptose. Electrophorèse sur gel de l’ADN isolé à partir de cellules totales (vivantes + mortes) dans des flacons témoins et traités. Ligne 1–8: ADN de cellules traitées avec 60, 80, 100, 120, 140, 150, 170 et 200 μg / ml d’extrait de WC dans 50% de DMSO, respectivement. La formation d’une échelle d’ADN induite par le WC, une caractéristique de l’apoptose. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.
- DiscussionLes avantages de l’utilisation de remèdes à base de plantes par rapport aux médicaments chimiothérapeutiques synthétiques sont multiples, d’autant plus que les agents synthétiques compromettent gravement l’homéostasie cellulaire normale et que, souvent, l’intervention thérapeutique offerte a une portée clinique limitée. Ainsi, toute stratégie thérapeutique devrait avoir pour objectif de cibler sélectivement les cellules cancéreuses / tumorales avec un minimum de dommages pour les cellules normales. Ces dernières années, les composés dérivés de produits naturels ainsi que leurs homologues synthétiques ont acquis une plus grande notoriété et une préférence accrue dans le domaine du traitement du cancer et ont un bon potentiel en tant qu’agents anticancéreux en raison de leur innocuité, de leur puissance et de leur efficacité [10]. Un certain nombre d’études épidémiologiques ont révélé que la plupart des végétariens et végétaliens rapportent une incidence moindre de cancer [14]. Ainsi, l’évaluation d’extraits de plantes pour l’identification et la présence de composés anticancéreux en termes de puissance et d’indice thérapeutique est devenue le pilier du traitement des cancers. De nos jours, près de 80% du médicament utilisé dans le monde à des fins diverses pour la santé est d’origine végétale, car il n’a pas ou très peu d’effets secondaires [15].Dans notre étude précédente, décrivant l’activité cytotoxique des extraits méthanolique et éthanolique de W. somnifera, il a été constaté que l’extrait méthanolique de WS possédait une IC50 de 40 et 30 μg / ml dans du DMSO à 10% et 50%, respectivement [12]. Valeurs IC50 de 51 et 40 μg / ml dans du DMSO à 10% et 50% respectivement, obtenues pour l’extrait de WC dans l’étude en cours. Les Withaferins sont les principaux composants actifs du genre Withania. À des fins de comparaison, la teneur en Withaferin-A de l’extrait méthanolique de WS s’est révélée plus élevée que celle de l’extrait méthanolique de WC, ce qui explique l’activité anticancéreuse plus élevée (IC50 inférieure) de l’extrait méthanolique de WS par rapport à l’extrait méthanolique de WC. .5. ConclusionLes extraits de fruits de W. coagulans peuvent être utilisés à l’avenir pour la formulation de nouveaux médicaments ou peuvent être utilisés en tant que traitement d’appoint / complémentaire en association avec le traitement principal. Des études avancées sur cette plante permettraient de comprendre le mécanisme détaillé de son activité anticancéreuse et apoptotique.
Conformité aux normes éthiquesAucune autorisation n’a été demandée au comité d’éthique de l’établissement, Era’s Lucknow Medical College, à Lucknow, car les travaux ne portaient pas sur des sujets humains ou animaux.Conflit d’intérêt
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Remerciements
Les auteurs souhaitent remercier MR K. Purshottam, responsable technique principal, laboratoire de CLHP, système sophistiqué d’instruments d’analyse, Institut de recherche pharmaceutique du CSIR-Centre, à Lucknow, pour avoir mené à bien les études de CLHP.
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