Shankhapushpi | Centre Ayurveda d'Aquitaine

Évaluation neuropharmacologique de quatre plantes traditionnelles utilisées comme tonique nervin et couramment utilisées en Shankhapushpi

Résumé

Objectif

La présente étude a été entreprise pour évaluer l’effet neuropharmacologique de quatre plantes couramment identifiées comme source de Shankhapushpi.

Contexte

Shankhapushpi est un médicament ayurvédique, largement utilisé pour ses actions sur le système nerveux central, en particulier pour améliorer l’intellect et stimuler la mémoire. Quatre plantes, à savoir, Canscora decussata Schult. (CD), Clitorea ternatea Linn. (CT), Convolvulus pluricaulis Choisy. (CP) et Evolvulus alsinoides Linn. (EA) sont considérées comme des sources de Shankhapushpi par les médecins, sur la base de leurs descriptions morphologiques données dans les textes anciens.

Matériels et méthodes

Des extraits méthanoliques des quatre variétés ont été testés et évalués in vitro et in vivo pour leurs effets neuropharmacologiques. Des expériences telles que la protection contre la neuro-toxicité induite par β-amyloïde sur la lignée cellulaire cérébrale (Neuro 2A), le potentiel antioxydant, l’inhibition de l’enzyme AchE (enzyme acétylcholinestérase) et l’inhibition de l’enzyme 5-LOX (lipoxygénase) ont été réalisées. Pour l’évaluation in vivo, la récupération de la mémoire induite par la scopolamine (0,3 mg / kg par voie intrapéritonéale) en utilisant un appareil type poteau d’escalade et le labyrinthe aquatique de Morris ont été effectués sur des modèles de rats.

Résultats

Il a été constaté que les effets protecteurs de EA et CD contre la neuro-toxicité induite par β-amyloïde dans les cellules Neuro 2A, étaient significativement plus élevés que CT et CP. L’EA s’est révélée supérieure aux autres variétés sur la base de l’activité anti-oxydante, de l’inhibition de l’AchE et des activités inhibitrices de la LOX. L’activité préventive de l’EA sur la récupération de mémoire induite par la scopolamine dans l’escalade de poteaux et la tâche de labyrinthe aquatique de Morris chez le rat s’est révélée supérieure à celle de CD, CT et CP.

Conclusion

EA a un effet neuropharmacologique remarquable par rapport aux trois autres variétés de Shankhapushpi. Cet effet peut être attribué à la présence de stéroïdes (stigmastérol et acide bétulinique), de coumarines (scopolétine) et de flavonoïdes (β-carotène et acide chlorogénique). Par conséquent, il peut être utilisé comme une avance prometteuse dans le développement et la gestion des troubles neuronaux, y compris la maladie d’Alzheimer.

Résumé graphique

Introduction

Shankhpushpi a été reconnu dans l’Ayurveda comme «Medhya Rasayana», ce qui signifie médicament rajeunissant, maintient et potentialise l’intellect et la mémoire. Sur la base de la forme de la fleur et de leur capacité à traiter les dysfonctionnements liés à la mémoire, quatre plantes, à savoir. Canscora decussata Schult. (CD) (Gentianaceae), Clitorea ternatea Linn. (CT) (Leguminosae), Convolvulus pluricaulis Choisy. (CP) (Convulvulaceae), et Evolvulus alsinoides Linn. (EA) (Convulvulaceae) sont considérés comme Shankhpushpi par les médecins indiens [1,2].

Différentes variétés de Shankhpushpi ont prouvé leur potentiel curatif individuellement dans des études liées à la dépression du SNC [3,4], anxiolytique [5], anti-amnésique [6,7], tranquillisant, antidépresseur, anti-stress, neurodégénératif, antioxydant, activité hypolipémiante, immunomodulatrice, analgésique, antifongique, antibactérienne, antidiabétique, antiulcéreuse, anti-catatonique et cardiovasculaire. Plusieurs types d’alcaloïdes, de terpénoïdes, de composés phénoliques, de flavonoïdes et de coumarines sont signalés en tant que substances chimiques actives responsables des effets biologiques [8].

Shankhpushpi (sous diverses formes posologiques) est l’un des produits à base de plantes largement commercialisés en Inde pour stimuler la mémoire et l’intellect [9]. La controverse est due à des noms synonymes de différentes variétés disponibles conduisant souvent à une sélection de matériel végétal avec une activité neuropharmacologique médiocre, ce qui entraîne une formulation moins puissante. Il existe également des études antérieures, liées à l’évaluation simultanée des activités nootropes, anxiolytiques et dépresseurs du SNC sur deux ou trois variétés de Shankhapushpi [10-15]. En outre, les auteurs ont également fait des études similaires dans le passé en se concentrant sur les activités anxiolytiques et de renforcement de la mémoire des différentes variétés de Shankhpushpi [4-7]. Cependant, jusqu’à ce jour aucune des études (y compris nos études précédentes) n’a évalué simultanément le profil neuropharmacologique complet de quatre variétés, ce qui a été fait dans le présent travail par les auteurs. Cela nous a aidés à déterminer laquelle d’entre elles est la meilleure en termes d’activité neuropharmacologique. Divers paramètres tels que la protection in vitro contre la neuro-toxicité induite par β-amyloïde sur la lignée cellulaire cérébrale (Neuro 2A), le potentiel antioxydant, l’inhibition de l’AchE, l’inhibition de l’enzyme 5-LOX et des expériences in vivo telles que la récupération de mémoire induite par la scopolamine, en utilisant un appareil d’escalade de poteaux et le labyrinthe aquatique de Morris, chez des rats, ont été réalisées.

Matériels et méthodes
2.1. produits chimiques et réactifs

Le milieu essentiel minimal d’Eagle (EMEM); Earle’s BSS (solution saline équilibrée); Le 2, 2-diphényl-1-picryl-hydrazyle (DPPH) (Himedia Laboratories Pvt Ltd., Mumbai, Inde). Le méthylthiazol tétrazolium (MTT) (bromure de 3- [4, 5-diméthyIthiazol-2-yl] -2, 5-diphényltétrazolium); β-amyloïde (1-40); L’iodure d’acétylthiocholine (ATCI); enzyme acétylcholinestérase (AchE) provenant d’érythrocytes humains; L’acide 5, 5-dithiobis [2-nitrobenzoïque] (DTNB); la galantamine; l’enzyme lipoxydase et l’acide linoléique ont été obtenus auprès de Sigma Ltd. (Mumbai, Inde). L’acide ascorbique a été obtenu auprès de Loba Chemie (Mumbai, Inde). La scopolamine (pur à 99,98%) a été obtenue en cadeau de Cadila Healthcare Pvt. Ltd. (Goa, Inde). La scopolamine a été dissoute dans une solution saline normale pour i.p. injection. Tous les produits chimiques et réactifs utilisés dans les expériences étaient de qualité analytique. Des plaques de CCM de gel de silice 60F254 pré-enrobées ont été achetées auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne).

2.2. Matériel végétal et préparation d’extraits

C.decussata (CD) a été recueilli à Ninai ghat (Gujarat, Inde) et identifié par le Dr S.C. Agrawal (Département de Botanique, CDRI, Lucknow, Inde). C.ternatea (CT), C.pluricaulis (CP) et E.alsinoides (EA) ont été collectés à la périphérie de Vadodara et identifiés dans le département de botanique de l’université M.S. de Baroda, Vadodara, Gujarat (Inde). Échantillons de référence des quatre plantes (N ° Pharmacy / CD / 09-10 / 13 / NS, Pharmacie / CT / 09-10 / 12 / NS, Pharmacie / CP / 09-10 / 11 / NS, et Pharmacie / EA / 09-10 / 10 / NS) ont été déposés au Herbal Drug Technology Lab, Département de pharmacie de l’Université. 1000 g d’herbe séchée à l’état sec et grossièrement en poudre de tous les médicaments ont été soumis à une extraction au Soxhlet avec du méthanol. Le solvant a été complètement éliminé sous pression réduite en utilisant un évaporateur rotatif. Le pourcentage de rendement de l’extrait de méthanol (ME) a été trouvé à 15,78 ± 0,01, 7,31 ± 0,06, 9,56 ± 0,03 et 10,36 ± 0,07% pour CD, CT, CP et EA respectivement.

2.3. Caractérisation de l’extrait

Des études de Chromatographie en couche mince à haute performance (HPTLC) ont été réalisées en utilisant divers systèmes de solvants comme indiqué dans nos études antérieures [9, 15-17].

2.4. Procédure expérimentale

2.4.1. Etudes neuropharmacologiques in vitro

2.4.1.1. Neuro-protection induite par β-amyloïde sur la lignée cellulaire cérébrale

2.4.1.1.1. Culture cellulaire et solutions mères

Neuro-2a (une lignée cellulaire de neuroblastome) a été obtenue auprès du Centre National des Sciences Cellulaires (NCCS) de Pune en Inde et cultivée en routine dans EMEM supplémenté avec 10% (v / v) de sérum foetal bovin (FBS), gentamicine (50 μg / ml) et de l’amphotéricine B (2,5 ug / ml) dans 10% de CO2 / 90% d’air humidifié à 37 ° C. Neuro-2A a été divisé en plaques de 96 puits à une concentration de 1 x 105 cellules par ml et laissé adhérer pendant 24 h à 37 ° C. La toxicité de Aß sur les cellules Neuro-2a a été évaluée par dosage MTT. Brièvement, les cellules Neuro-2a ont été exposées à Aß1-40 (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM et 15 μM) pendant 24 h et le taux de réduction du MTT a été enregistré [18]. Après évaluation de la toxicité, Neuro-2a avec (10 μM) ou sans Aβ1-40 (dissous dans de l’eau apyrogène) plus différentes concentrations (10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM, 100 μM et 200 μM) d’extrait de méthanol de Shankhpushpi botanicals viz. MECD, MECT, MECP, MEEA ont été dilués dans du DMSO. La concentration finale de DMSO dans chaque échantillon était de 0,1%, et cette concentration n’a pas affecté la croissance cellulaire ou la mort.

2.4.1.1.2. Test de viabilité cellulaire MTT

Un test de conversion MTT a été utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire dans chaque condition de traitement [19]. Le test MTT repose principalement sur la capacité métabolique mitochondriale des cellules viables et reflète l’état redox intracellulaire. Après incubation, les cellules ont été traitées avec la solution de MTT (concentration finale: 1 mg / mL) pendant 3 h. Les cristaux de formazan bleu foncé formés dans des cellules intactes ont été solubilisés avec du tampon de lyse [20% (p / v) de dodécylsulfate de sodium dans du N, N-diméthylformamide aqueux à 50% (v / v) avec un pH ajusté de 4,5]. La densité optique de chaque puits a été mesurée avec un spectrophotomètre pour microplaques à 96 puits (Bio-Rad, Hercules, CA, USA, Benchmark) à la longueur d’onde d’essai de 570 nm.

2.4.1.2. Dosage du piégeage des radicaux hydroxyles et de l’activité anti-oxydante totale

DPPH radical-piégeage, antioxydant réducteur ferrique (FRAP) et les méthodes complexes de phosphomolybdène ont été utilisés pour évaluer le piégeage des radicaux hydroxyles et la capacité anti-oxydante totale des échantillons [20]. Cinq concentrations différentes (100, 200, 300, 400 et 500 ug / ml) d’extrait de méthanol à savoir, MECD, MECT, MECP et MEEA ont été utilisées. La vitamine E a été utilisée comme référence pour toutes les trois méthodes.

2.4.1.3. Essai de microplaque d’inhibition de l’acétylcholinestérase

L’activité d’AchE a été mesurée en utilisant un lecteur de microplaques à 96 puits basé sur la méthode d’Ellman. L’absorbance a été mesurée à 405 nm toutes les 13 s pendant 65 s. 25 μL de 0,22 U / ml d’enzyme AchE ont été ajoutés et l’absorbance a de nouveau été lue toutes les 13 s pendant 104 s à l’aide du 680 XR Microplate Reader S / N 10519 [21]. Le pourcentage d’inhibition a été calculé en comparant l’échantillon à l’ébauche. Des gammes de concentrations différentes (50, 100, 150, 200 et 250 μg / ml) d’extraits de méthanol (MECD, MECT, MECP et MEEA) ont été utilisées. La galantamine a été utilisée comme étalon de référence pour l’étude.

2.4.1.4. Test d’inhibition de l’enzyme lipoxygénase (LOX)

Le test d’inhibition de l’enzyme LOX a été réalisé en utilisant l’acide linoléique comme substrat et la lipoxydase comme enzyme. L’extrait méthanolique de chaque variété a été dissous séparément dans 0,25 ml de tampon borate 2 M (pH 9,0) et 0,25 ml de solution d’enzyme lipoxydase (20 000 U / ml) a été ajouté et incubé pendant 5 minutes à 25 ° C. En outre, 1 ml de solution d’acide linoléique (0,6 mM) a été ajouté, bien mélangé et l’absorbance a été mesurée à 234 nm. Différentes concentrations (50, 100, 150, 200 et 250 μg / ml) des extraits d’essai ont été tracées pour déterminer les valeurs de CI50. La rutine a été utilisée comme étalon de référence [21].

2.4.2. Études in vivo

2.4.2.1. Animaux

Des rats mâles Sprague-Dawley (poids 200-250 g, âge 2-3 mois) ont été utilisés pour l’étude. Les animaux ont été logés par groupes de six dans des cages en polypropylène, dans des conditions standard de température de laboratoire (25 ± 2 ° C), d’éclairage (08h00 – 20h00) et d’humidité relative (50 ± 5%). à la pastille standard de granulés (Brooke Bond-Lipton, Inde) et à l’eau. Les animaux ont été acclimatés pendant 7 jours avant le début de l’étude. Toutes les expériences ont été menées entre 09h00 et 14h00. Protocole expérimental a été approuvé par le Comité institutionnel d’éthique animale (AIVE) de B.R. Collège de pharmacie de Nahata, Mandsaur (règlement n ° 918 / ac / 05 / CPCSEA).

2.4.2.2. Évaluation de l’activité nootropique par l’amnésie induite par la scopolamine

L’activité nootropique a été évaluée à l’aide de l’appareil d’escalade de poteaux de Cook et Weidley et de la tâche de labyrinthe aquatique de Morris. Les animaux ont été divisés en sept groupes (n = 6). Le groupe I a reçu le véhicule (eau distillée), le groupe II a reçu la scopolamine (0,3 mg / kg ip) comme témoin négatif, le groupe III a reçu le piracétam (100 mg / kg po) comme témoin positif et le groupe IV-VII a reçu des extraits méthanoliques (400 mg / kg po) de CD, CT, CP et EA.

2.4.2.3. L’appareil d’escalade de Cook et Weidley

Brièvement, l’appareil d’escalade à perche de Cook et Weidley [21] consiste en une chambre expérimentale transparente insonorisée avec un plancher grillagé et un courant électrique qui doit être considéré comme une zone de choc qui a été initiée avec un signal sonore. La chambre avait un couvercle de couverture transparent auquel une perche de bois vissée dans la surface interne, agissait comme la zone sans choc (Medicraft Electromedicals Pvt Ltd., Inde). L’état du stimulus était un choc au pied de 0,75 mA donné à chaque rat pendant une période de 2 s à partir du plancher de la grille électrifiée, afin de leur apprendre à éviter le courant électrique en grimpant sur le poteau en bois, la zone sans choc. Trois séances d’essais entrecoupées d’un intervalle de 10 s ont été effectuées quotidiennement. Au cours de chacun des essais, les rats ont été autorisés à explorer l’appareil pendant 10 s, y compris une période de choc de 2 s. La sensibilité des rats vis-à-vis du choc du pied a été mesurée et seuls les rats sensibles au choc et susceptibles de grimper au pôle ont été inclus dans l’expérience. Les médicaments tests et le véhicule ont été administrés par voie orale une fois par jour pendant 14 jours avant le début de l’expérience. Tous les groupes ont été formés quotidiennement pour apprendre. L’essai de formation (TT) a été réalisé après 7 jours de traitement. Vingt-quatre heures plus tard, le jour 8, un essai de rétention (RT) a été mené et le nombre de réponses d’évitement (AR) dans les 10 sessions d’essai a été noté. Au jour 9 de l’expérience, après avoir terminé l’entraînement, tous les animaux, sauf le contrôle, ont été traités avec une dose unique de scopolamine (0,3 mg / kg i.p.), 30 min avant l’administration des extraits. Le programme de formation a été poursuivi en outre avec l’administration quotidienne de médicaments de test jusqu’à 15 jours, pour l’évaluation complète de la rétention de la mémoire en termes d’essai de rétention.

2.4.2.4. Tâche du labyrinthe d’eau de Morris

Le labyrinthe aquatique de Morris a été décrit comme une performance de nage forcée d’animaux en présence d’une plateforme cachée. La première journée expérimentale a été consacrée à quatre séances d’entraînement en natation de 60 s en présence de la plateforme. Le deuxième jour, les rats ont eu quatre séances d’essai avec la plate-forme en place. L’intervalle de temps entre chaque session d’essai était de 30 minutes. Pendant huit séances d’essai, des rats ont été placés à chaque fois dans l’eau faisant face au mur de la piscine dans l’un des quadrants de la piscine. Le point d’entrée a été modifié dans un ordre différent tous les jours. Quand un rat a localisé la plate-forme, il a été autorisé à rester dessus pendant 10 s. Si le rat n’a pas localisé la plate-forme dans les 60 s, il a été placé sur la plate-forme pendant 10 s. Après chaque essai, l’animal humide a été remis dans une cage, séché avec une serviette et laissé sécher sous une lampe infrarouge. Lors de chaque session d’essai, le temps nécessaire pour trouver la plate-forme cachée (latence) a été enregistré. Après la dernière séance d’entraînement, la plateforme a été retirée de la piscine et les rats ont été autorisés à nager pendant 60 secondes pour la rechercher. On a tenu un registre du nombre de passages au-dessus de la plate-forme dans le quadrant de la piscine où la plate-forme avait été placée auparavant. Les médicaments d’essai et le véhicule ont été administrés par voie orale une fois par jour pendant 14 jours. Le 14ème jour, une dose unique de scopolamine (0,3 mg / kg i.p.) a été administrée 45 minutes avant le début du test du labyrinthe aquatique Morris. Tous les groupes, à l’exception du véhicule traité, ont reçu de la scopolamine. Ensuite, les rats ont été exposés à des séances d’entraînement en utilisant le labyrinthe aquatique Morris pendant deux jours consécutifs avant la décapitation. La concentration maximale du médicament survient environ 30 minutes après l’administration de scopolamine [22].

2.5. L’analyse des données

Toutes les analyses ont été réalisées en triple et les résultats ont été exprimés en moyenne ± SEM. L’analyse de régression a été utilisée pour calculer IC50, définie comme la concentration d’inhibiteur nécessaire pour 50% d’inhibition de la réaction enzymatique. Pour les études animales, les données ont été exprimées en moyenne ± SEM et analysées par ANOVA à un facteur suivi de post-test de comparaison multiple de Bonferroni. Les valeurs P et F et les degrés de liberté ont été calculés. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Californie).

Résultats3.1. Caractérisation de l’extrait
Les études HPTLC ont révélé la présence de divers composés phyto-chimiques indiqués dans le tableau 1, tel que rapporté et publié dans nos études antérieures et peuvent être utilisés pour la différenciation phyto-chimique entre quatre variétés de Shankhpushpi [9,15-17].

Tableau 1.
Caractérisation de chaque extrait de méthanol de Shankhpushpi botanicals. MECD, MECT, MECP et MEEA respectivement.

MECD                           MECT                           MECP                            MEEA
Stigmastérol                Stigmastérol                Stigmastérol                Stigmastérol
Acide ursolique           Lupéol                          Scopoletine                 Acide bétulinique
Mangiferin                  Acide Ursolique                                                 Scopoletine
Scopoletine                 Scopoletine                                                         β-carotène
β-carotène                   β-carotène Rutin                                               Acide chlorogénique

3.2. Neuro-protection induite par β-amyloïde sur la lignée cellulaire cérébrale

La toxicité de Aß1-40 sur les cellules Neuro-2a a été évaluée par dosage MTT. Il a été confirmé que lorsque les cellules Neuro-2a étaient exposées à Aß1-40 (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM et 15 μM) pendant 24 h, le taux de réduction du MTT était diminué dans une concentration dépendante. manière (figure 1). Par conséquent, une concentration fixe de Aß1-40, 2,5 uM, a été utilisée pour la détermination de l’endommagement des cellules Neuro-2a induites par Aßl-40. Les cellules Neuro-2a ont été incubées dans du milieu de culture contenant 2,5 uM d’Aßl-40 avec ou sans extraits d’essai, à savoir. MECD, MECT, MECP, MEEA. Comme le montre la figure 2, MEEA et MECD ont protégé de manière significative les cellules Neuro-2a contre l’effet cytotoxique de Aßl-40. Après 24 h d’exposition à 2,5 μM de Aβ1-40 seul, le degré de réduction du MTT par les cellules Neuro-2a a été diminué et MEEA et MECD ont augmenté significativement la viabilité cellulaire. Une analyse plus approfondie a révélé que les effets protecteurs de MEEA et MECD étaient significativement meilleurs que MECT et MECP (figure 2).

Fig. 1. Caractérisation de la mort neuronale induite par Aß1-40 dans des cellules Neuro-2a. La viabilité cellulaire à 24 h a été déterminée en mesurant la capacité à réduire le MTT en pourcentage de la capacité des cellules témoins. Les résultats sont la moyenne ± SEM. (n = 3), *** p <0,001 par rapport au groupe témoin sans Aß1-40.

Fig. 2. Effet de l’extrait au méthanol de divers végétaux de Shankhpushpi sur la mort des cellules Neuro 2A induites par Aß1-40. Les cellules Neuro 2A ont été incubées dans du milieu de culture contenant 10 μM de Aβ1-40 avec ou sans les extraits suivants: MECD, MECT, MECP et MEEA. La viabilité cellulaire à 24 h a été déterminée en mesurant la capacité à réduire le MTT en pourcentage de la capacité des cellules témoins. Les résultats sont la moyenne ± SEM (n = 3). ANOVA à un facteur suivi d’un test de comparaison multiple de Bonferroni [*** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05; F = 26,59, df (5, 30) = 35].

3.3. Dosage du piégeage des radicaux hydroxyles et de l’activité anti-oxydante totale

Les effets révélateurs radicaux et l’activité anti-oxydante totale des extraits de méthanol (MECD, MECT, MECP et MEEA) sont représentés dans le tableau 2. Les résultats ont révélé que MEEA possède l’effet anti-radicalaire le plus élevé, avec une valeur IC50 de 18,21 ± 0,51. Le MEEA possédait également un potentiel antioxydant supérieur avec une valeur IC50 de 20,38 ± 0,37 par FRAP (pouvoir antioxydant réducteur de fer) et de 20,63 ± 0,30 μg / ml par la méthode du complexe de phospho-molybdène. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT dans les trois méthodes.

Tableau 2. Activité anti-oxydante et anti-radicaux hydroxyle comparative de l’extrait méthanolique de divers produits botaniques de Shankhpushpi.

Treatments	IC₅₀ value (μg/ml)
Treatments	DPPH	FRAP	Phosphomolybdenum
Vitamin E	13.62 ± 2.03	12.39 ± 0.17	4.41 ± 0.08
MECD	19.15 ± 0.35^ns	21.65 ± 0.15***	21.62 ± 0.40***
MECT	36.09 ± 2.10***	66.71 ± 1.28***	24.64 ± 1.73***
MECP	25.46 ± 0.08**	26.94 ± 0.14***	22.11 ± 0.41***
MEEA	18.21 ± 0.51^ns	20.38 ± 0.37***	20.63 ± 0.30***

Toutes les valeurs sont moyennes ± SEM (n = 6). ANOVA à un facteur suivi de post-tests de Bonferroni sans tenir compte de toutes les valeurs p. nsp> 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 par rapport à la vitamine E pour les trois expériences séparées.

3.4. Essai de microplaque d’inhibition de l’acétylcholinestérase
Le MEEA a montré une activité sensiblement plus élevée que les trois autres variétés et a inhibé l’AchE avec une valeur de CI50 de 65,67 ± 11,32 μg / ml (Tableau 3). La galantamine a été utilisée comme témoin positif, a montré une inhibition avec une valeur de CI50 de 4,68 ± 0,16 ug / ml. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT.

Tableau 3. Activité inhibitrice comparée de l’acétylcholinestérase (AchE) et de la lipoxygénase (LOX) de l’extrait au méthanol de diverses plantes Shankhpushpi.

Treatments	IC₅₀ value (μg/ml)
Treatments	AchE	LOX
Rutin^A	Not applicable	4.21 ± 0.17
Galantamine^B	4.68 ± 0.16	Not applicable
MECD	65.88 ± 3.78*	28.39 ± 1.24***
MECT	132.40 ± 18.96***	114.35 ± 0.99***
MECP	107.99 ± 7.57**	81.76 ± 2.07***
MEEA	65.67 ± 11.32*	19.04 ± 0.78***

Où «A» est utilisé comme contrôle positif pour LOX et «B» est utilisé comme contrôle positif pour AchE. Toutes les valeurs sont moyennes ± SEM (n = 6). ANOVA à un facteur suivi de post-tests de Bonferroni sans tenir compte de toutes les valeurs p. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 comparé à la galantamine pour AchE et à la rutine pour LOX.

3.5. Test d’inhibition de l’enzyme lipoxygénase (LOX)

Parmi tous les extraits de méthanol testés, MEEA a montré une activité plus élevée et inhibé l’enzyme LOX avec la valeur IC50 de 19,04 ± 0,78 ug / ml (tableau 3). La rutine a été utilisée comme témoin positif, a montré une inhibition avec une valeur CI50 de 4,21 ± 0,17 ug / ml. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT.

3.6. Évaluation de l’activité nootropique par l’amnésie induite par la scopolamine

Le test d’évitement inhibiteur conduit par l’administration d’amnésie induite par la scopolamine a entraîné une réduction du nombre de réponses d’évitement. Cependant, le traitement continu de MEEA a produit une meilleure rétention et récupération par rapport aux extraits des trois autres variétés.

3.6.1. L’appareil d’escalade de Cook et Weidley

Il y avait une augmentation significative de la rétention de la mémoire et de la récupération dans les groupes traités par MEEA. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT. Une ANOVA à un facteur suivie du post-test de comparaison multiple de Bonferroni, menée sur la réponse d’évitement des rats lorsqu’ils ont reçu une seule dose de scopolamine le 9ème jour, suivie d’essais le 10, 11, 12, 13, 14 et 15 jours. que les groupes traités par l’extrait de Shankhpushpi présentaient une valeur significative [**** p <0,0001, *** p <0,001, ** p <0,01; F = 114,1; df (4, 40) = 44] augmentation du nombre de RA par rapport aux groupes traités à la scopolamine et au véhicule (figure 3). L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT.

Fig. 3. Effet de l’extrait méthanolique de divers végétaux de Shankhpushpi sur l’activité nootropique par amnésie induite par la scopolamine chez des rats en utilisant l’appareil d’escalade de Cook et de Weidley. Toutes les valeurs sont moyennes ± SEM (n = 6). ANOVA à un facteur suivi de tests de comparaison multiple de Bonferroni [*** p <0,0001, *** p <0,001, ** p <0,01; F = 114,1; df (4, 40) = 44].

3.6.2. Tâche de labyrinthe de l’eau Morris

Les données du tableau 4 montrent l’amélioration comparative de l’apprentissage dépendant de la mémoire par traitement avec des extraits méthanoliques. MEEA a révélé une augmentation significative et comparative du temps de latence chez les rats traités à la scopolamine en comparaison avec d’autres et le témoin correspondant [**** p <0,0001; *** p <0,0005; ** p <0,005; * p <0,05; F = 14,42; df (6, 35) = 41]. Tous les groupes traités par l’extrait présentent une diminution du temps de latence par rapport aux rats traités à la scopolamine correspondants. Ces rats ont montré une diminution significative du nombre de croisements sur la position de la plate-forme par rapport au contrôle correspondant. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT.

Tableau 4. Effet de l’extrait méthanolique de divers végétaux de Shankhpushpi sur l’amnésie induite par la scopolamine par le test de maïs aqueux de Morris.

Treatment# (mg/kg)	Escape Latency
Treatment# (mg/kg)	60 Seconds^a	Crossing the platform in 7 trials^b
Vehicle	32.89 ± 6.74****	5.66 ± 0.33****
Scopolamine	48.52 ± 0.25	1.66 ± 0.33
Piracetam	19.22 ± 0.21****	6.33 ± 0.33****
MECD	26.03 ± 0.07****	4.66 ± 0.33****
MECT	36.05 ± 0.12*	2.33 ± 0.33ns
MECP	30.02 ± 0.09***	2.66 ± 0.33ns
MEEA	23.08 ± 0.02****	5.33 ± 0.33****

Les médicaments d’essai et le véhicule ont été administrés par voie orale une fois par jour pendant 14 jours. Le 14ème jour, une dose unique de scopolamine (0,3 mg / kg i.p.) a été administrée 45 minutes avant le début du labyrinthe aquatique Morris. Tous les groupes, à l’exception du véhicule traité, ont reçu de la scopolamine. ANOVA à un facteur suivi des tests de comparaison multiple de Bonferroni. Toutes les valeurs sont moyennes ± SEM (n = 6). [**** p <0,0001; *** p <0,0005; ** p <0,005; * p <0,05; F = 14,42; df (6, 35) = 41].

4. Discussion

L’utilisation synonyme du mot «Shankhpushpi» pour différentes variétés crée une controverse quant à leur identité qui se traduit souvent par l’utilisation d’une variété moins puissante dans les formulations à base de plantes [23]. Le présent travail fournit une évaluation neuropharmacologique comparative, qui était nécessaire pour identifier l’amplificateur de mémoire le plus approprié parmi eux. Bien que toutes les plantes soient testées individuellement et qu’elles soient actives dans divers paramètres impliquant des expériences in vitro et in vivo, elles diffèrent encore quant à leur efficacité pharmacologique.

Plusieurs des composés phyto-chimiques présents dans Shankhpushpi sont rapportés individuellement pour posséder des activités liées à l’action anti-oxydante, à la dysfonction de la mémoire et à la stimulation du SNC [24,25]. La présence et l’absence de tels composés phyto-chimiques dans différentes variétés de Shankhpushpi créent une confusion quant à la variété la plus puissante [8].
Il a été rapporté que des peptides β-amyloïdes ont été utilisés pour initier une neuro-toxicité dans des cellules cultivées Neuro-2a (lignées cellulaires de neuro-blastome) [26]. Les effets toxiques des peptides β-amyloïdes tels que trouvés dans nos études (Fig. 2) sont en accord avec les données précédemment rapportées dans les cellules neuronales [27]. Le test MTT a été rapporté pour mesurer les effets protecteurs des extraits de plantes et des composés sur la viabilité cellulaire. Afin de déterminer et de comparer l’effet de quatre variétés contre la neuro-toxicité induite par Aßl-40, un test de protection cellulaire à base de MTT a été effectué. L’ordre de la protection cellulaire contre les dommages neurotoxiques induits par Aß1-40 s’est révélé être MEEA> MECD> MECP> MECT (figure 2). Ces données soutiennent l’activité neuro-protectrice des médicaments testés en réduisant le dépôt de β-amyloïde dans le cerveau pour protéger contre les troubles de la mémoire.
Il a été établi plus tôt que le vieillissement cérébral est principalement associé à l’action des radicaux libres [28]. Dans la présente étude, la capacité de piégeage des radicaux libres et les capacités anti-oxydantes totales de quatre plantes Shankhpushpi ont été mesurées en utilisant la réaction de la méthode DPPH, FRAP et phosphomolybdène. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT dans toutes les trois méthodes effectuées. Ces données soutiennent l’activité neuro-protectrice des médicaments testés, le mécanisme sous-jacent étant le piégeage des radicaux libres et l’action anti-oxydante sur les cellules du cerveau, fournissant une action protectrice contre le dysfonctionnement de la mémoire.

La perturbation de la neurotransmission cholinergique dans le cerveau contribue au déclin cognitif et à la progression du dysfonctionnement de la mémoire [29,30]. La présente étude dépeint que tous les quatre botaniques Shankhpushpi ont inhibé AchE de manière significative et protégé la perte de neurotransmetteur AchE, qui est directement responsable de la fonction cognitive. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT.
Il a été rapporté plus tôt que la 5-lipooxygénase est une enzyme clé dans la biosynthèse du leucotriène, qui a été postulée pour jouer un rôle important dans la physiopathologie des troubles neurodégénératifs associés au vieillissement [31]. La présente étude a révélé que les quatre plantes Shankhpushpi inhibaient significativement la 5-LOX, qui est directement responsable des troubles neurodégénératifs. L’ordre d’activité était MEEA> MECD> MECP> MECT.

Nous avons également confirmé nos résultats d’études in vitro en adoptant divers protocoles animaux rapportés précédemment pour l’évaluation de l’activité nootropique. Nous avons évalué l’activité nootropique par l’appareil d’escalade de poteau de Cook et Weidley et la tâche de labyrinthe aquatique de Morris sur le modèle d’amnésie induite par la scopolamine. Il a été observé que les animaux recevant uniquement de la scopolamine le jour 9 (appareil de grimpe de Cook et Weidley) et le jour 14 (labyrinthe aquatique de Morris) présentaient une perte de mémoire considérable et que l’amnésie produite persistait. Il existe des preuves substantielles que le blocage des récepteurs muscariniques par des médicaments comme la scopolamine entraîne des perturbations de diverses tâches liées à l’exécution de la mémoire [32,33]. La réduction du nombre de réponses d’évitement est une preuve d’amnésie au cours du test d’évitement inhibiteur mené après l’administration de scopolamine. Cependant, il est évident dans nos expériences qu’un traitement continu avec des extraits méthanoliques de quatre plantes Shankhpushpi individuellement produit une meilleure rétention et récupération. L’ordre d’activité dans les deux tâches effectuées in vivo s’est avéré être MEEA> MECD> MECP> MECT, ce qui est similaire aux résultats in vitro.

Ainsi, les effets anti-amnésiques de Shankhpushpi sur l’amnésie induite par la scopolamine en utilisant l’appareil d’escalade de poteau de Cook et Weidley et la tâche de labyrinthe aquatique de Morris ont été démontrés avec succès à travers l’étude. Il a été prouvé que l’EA était la plus puissante pour la mémoire et les troubles apparentés dans de nombreuses études antérieures [7,1 2,34]. EA a possédé une activité plus élevée que les autres en tant que preuve de toutes les expériences réalisées dans les études actuelles.

5. Conclusion

Les résultats confirment que l’utilisation traditionnelle de Shankhpushpi pour son action neuropharmacologique et de fournir une grande pertinence pour son utilisation dans la prévention et les thérapies de la mémoire et les dysfonctionnements liés au système nerveux central. Les effets bénéfiques comparatifs de E.alsinoides sur les autres plantes Shankhpushpi en font un agent prometteur pour les essais cliniques contrôlés afin d’établir son innocuité et son efficacité en tant qu’antioxydant, agent prophylactique analogue à l’AINS, inhibiteur de la NMDA et activateur de l’acétylcholinestérase pour la protection contre la MA. possiblement d’autres maladies neurodégénératives liées à l’âge. Les résultats de l’activité neuropharmacologique suggèrent que E.alsinoides devrait être utilisé comme la véritable source de Shankhpushpi alors que les trois autres plantes peuvent être utilisées comme ses substituts.

Sources de financement

L’un des auteurs, Neeraj K. Sethiya, reconnaît le soutien financier de la Commission des subventions universitaires, New Delhi, Govt. de l’Inde, pour l’octroi d’une bourse de recherche junior (F. n ° 10-01 / 2008).

Conflit d’intérêt

Aucun.

Reconnaissance

Les auteurs souhaitent exprimer leurs sincères remerciements au directeur, B.R. Nahata Smriti Sansthan, Centre de recherche sous contrat, Mandsaur (M.P.), Inde, pour avoir accordé la permission d’effectuer des études in vivo. Nous aimerions également remercier Cadila Healthcare Pvt. Ltd, Goa, Inde pour avoir fourni un échantillon de scopolamine.

References

[1]

N.K. Sethiya, A. Trivedi, M.B. Patel, S.H. MishraComparative pharmacognostical investigation on four ethnobotanical traditionally used as Shankhpushpi in India

J Adv Pharm Technol Res, 1 (2010), pp. 388-395