Activité antivirale de l’extrait éthanolique de Nilavembu Kudineer contre le virus de la dengue et du chikungunya par évaluation in vitro
Points forts
• Andrographis est une composante majeure de Nudavembu kudineer.
• Andrographis est plus cytotoxique lorsqu’il est utilisé séparément et est donc utilisé comme formulation polyherbal.
• L’extrait à l’éthanol de Nilavembu Kudineer (NVK) présente des propriétés antivirales.
• La NVK a un effet prophylactique lors d’une infection par le chikungunya et le virus de la dengue (respectivement CHIKV et DENV).
• NVK présente une activité antivirale pendant les infections à CHIKV et à DENV actives.
Résumé
Contexte
Actuellement, aucun vaccin ou médicament moderne n’est disponible pour la dengue et le chikungunya et seul un soulagement symptomatique est fourni aux patients. La médecine Siddha, une forme traditionnelle du système médical autochtone, utilise avec un succès considérable des formulations polyherbal spécifiques pour le traitement de ces infections. Une telle formulation polyherbal pour le traitement du chikungunya et de la dengue est le Nilavembu kudineer (NVK). Les détails mécanistes de ce médicament en tant qu’antiviral pour le virus du chikungunya (CHIKV) et le virus de la dengue (DENV) sont mal compris.
Objectifs
La présente étude visait à étudier l’efficacité de la NVK en tant que formulation antivirale contre le CHIKV et le DENV.
matériaux et méthodes
Des tests de cytotoxicité (MTT) ont été effectués pour déterminer le rôle de la NVK en tant qu’antiviral lors d’infections par le chikungunya et la dengue dans les conditions suivantes: i). post-infection, ii). lors d’infections actives et iii) protectrices, ne permettant pas l’infection virale.
Résultats
Il a été observé que NVK offre une protection contre le CHIKV et le DENV-2 au cours d’une infection active, ce qui peut également aider à prévenir l’infection par le virus dans les cellules et dépend principalement de la disponibilité cellulaire de médicaments pour une protection maximale contre les deux infections.
Conclusion
Notre étude établit que les protocoles d’extraction sont importants pour assurer une efficacité maximale de la NVK ainsi que le temps d’addition du médicament lors d’infections par le CHIKV et le DENV dans les cellules. Cette étude fournit des informations sur le mode d’action possible de la NVK dans des conditions in vitro au cours d’une infection par le CHIKV et le DENV.
Résumé graphique
Mots clés
Nilavembu Kudineer (Andrographis paniculata), Vettiver (Vetiveria zizanioides), Vilamiccam ver (Vetiveria zizanioides), Cantanam (Santalum album), Peyputtal (Trichosanthes cucumerina), Koraik kilanku(Cyperus rotandus), Cukku (Zingeber officinale), Milaku (Piper nigrum), Parpatakam (Mollugo cerviana)
Andrographis
Siddha
Virus Chikungunya (CHIKV)
Virus de la dengue (DENV)
In vitro
- IntroductionLe système de médecine Siddha est l’une des branches les plus anciennes du système médical indien traditionnel et remonte à la période sangam (500BCE-500CE) [1], [2], [3]. Ce système de médecine suit l’approche holistique des soins de santé [4], [5], [6] et est basé sur le concept de cinq proto-éléments et de trois doshas [7], [8]. Selon ce système de médecine, la fonction physiologique dans le système humain est médiée par trois substances (Tridosham), à savoir. i) le vent (Vatham) ii) la bile (Pitham), iii) le flegme (Karpam) [8]. Si ces trois substances fonctionnent normalement dans le rapport 4: 2: 1 respectivement [2], [8], un état de santé normal est maintenu. L’évolution de ce ratio entraînera diverses maladies [8]. Les formulations polyherbal du système de médecine Siddha sont utilisées individuellement ou en combinaison pour maintenir le rapport d’équilibre de la santé humaine. La médecine Siddha soutient que les trois humeurs prédominent les humains en fonction de leur nature et de leur stade de la vie et qu’elles varient avec les saisons [9]. Le système de médecine Siddha est principalement concerné par le développement de formulations polyherbal, qui ont une puissance élevée et une longue durée de vie pour leur utilisation future. Il vise également à activer la génération de cellules et à maintenir leur longévité [10]. Les ressources du système de médecine siddha ont été classées en trois groupes: les produits végétaux (mulavargam), les substances inorganiques (thathuvargam) et les produits d’origine animale (jivavargam), caractérisés par le goût (suvai), la qualité (gunam), la puissance ( veeryam), goût post-digestif (pirivu) et action spécifique (prabhavam) [11], [12].
Selon la littérature siddha, les facteurs extrinsèques (externes) et intrinsèques (internes) sont à l’origine de la maladie [10]. Les causes intrinsèques incluent le dérangement des trois humeurs et les causes extrinsèques comprennent le climat, l’habitat, l’environnement, les traumatismes, les morsures toxiques, les accidents, etc. [7]. Le concept d’épidémie est très bien défini et établi dans l’Ayurveda et le Siddha. Charaka (1500BC – 400AD), le grand médecin de l’Ayurveda, avait évoqué l’épidémie sous le nom de «Janapadodwamsa» [10] sous le nom de Senkaraisuram [13]. Selon la littérature siddha, la contamination et la corruption des facteurs environnementaux tels que l’eau, l’air, le lieu et la saison sont responsables de la production d’épidémies et du déséquilibre des doshas [8], [10] chez les hôtes, ce qui les rend plus réceptif aux maladies. La dengue et le chikungunya sont des entités apparues comme une épidémie dans tout le pays, causant inconfort et morbidité aux personnes touchées. De nos jours, les maladies d’origine hydrique, les maladies environnementales, les désordres épidémiologiques et saisonniers dus aux infections peuvent être mis en corrélation avec Janapadodhwamsa Vyadhis (maladies épidémiques ou endémiques), terme médical bien défini dans le système médical traditionnel indien. Ayurveda and Siddha propose plusieurs médicaments uniques, des combinaisons à base de plantes et des mélanges herbo-minéraux, qui peuvent être utilisés de manière rationnelle pour lutter contre de telles conditions [8], [10].
La dengue et le chikungunya sont des infections à arbovirus causées respectivement par un flavivirus, le DENV et un alphavirus, le CHIKV [14]. Dans un pays comme l’Inde, la dengue et l’infection à chikungunya peuvent se présenter sous forme d’infections uniques ou co-infectées [14], [15]. Actuellement, il n’existe pas de médicaments autorisés pour ces infections dans la médecine moderne et les cliniciens ont recours à un soulagement symptomatique pour lutter contre ces infections. Cependant, à Siddha, ces deux infections sont efficacement traitées par un traitement médicamenteux spécifique appelé traitement. Le schéma thérapeutique utilisé pendant les premiers jours d’infection dans le traitement à la fois de la fièvre chikungunya (FK) et de la dengue (DF) comprend une formulation commune, à savoir le Nilavembu Kudineer (NVK) [16]. NVK est une préparation polyherbal avec Andrographis paniculata comme ingrédient principal contrôlant tous les types de fièvre associés aux maux de corps. Cette herbe communément appelée le neem de terre, la bile de terre et le roi des amers est originaire d’Inde et du Sri Lanka [17]. Vettiver (Vetiveria zizanioides), Vilamiccam ver (V. zizanioides), Cantanam (Santalum album), Peyputtal (Trichosanthes cucumerina), Koraik kilanku (Cyperus rotandus), Cukku (Zingeber officinale), Milaku (Piper nigrum) et Penuk Mollugo cerviana) [16], [18]. Toutes ces plantes sont traditionnellement utilisées dans le traitement de la fièvre, de l’inflammation, de l’arthralgie, de l’arthrite, de l’ulcère gastrique, de la jaunisse et de l’affaiblissement général, formulées dans le but de gérer la FK et le DF. NVK contrôle la fièvre de manière globale grâce à ses effets curatifs de régulation de la température, de contrôle de l’inflammation et de soulagement de la douleur corporelle. Il agit de manière à renforcer l’immunité [16], [18]. La présente étude a été réalisée dans le but d’étudier les effets antiviraux de l’extrait à l’éthanol de Nilavembu kudineer contre l’infection par le CHIKV et le DENV dans des conditions in vitro.
- Matériels et méthodes1. Ligne cellulaire et maintenance
Les lignées cellulaires Vero (ATCC® CCL-81 ™) HEK-293T (ATCC® CRL-11268 ™) et BHK-21 (ATCC® CCL-10 ™) ont été maintenues à 37 ° C dans du milieu DMEM (Himedia, AL007A) complété par 10% de FBS, antibiotiques et l-glutamine. La lignée cellulaire THP-1 (ATCC® TIB-202 ™) a été maintenue à 37 ° C dans un milieu RPMI additionné de 10% de FBS et d’antibiotiques.
2.2. Isolement, propagation et amplification de CHIKV et DENV
Le CHIKV et le DENV-2 ont été dérivés d’échantillons de sérum prélevés chez des patients virémiques lors d’une épidémie [19], [20]. En bref, 20 ul d’échantillon de sérum infecté ont été inoculés dans une plaque confluente à 6 puits de cellules C6 / 36 pendant 6 jours. Ensuite, un flacon T-150 confluent à 90-100% de cellules Vero et BHK-21 a été utilisé pour l’amplification de CHIKV et de DENV-2, respectivement, tous les milieux sauf 2,5 ml ont été prélevés. 50 ul de stocks de virus préparés comme indiqué ci-dessus (environ 0,1 MOI) ont été ajoutés au ballon et homogénéisés. Le ballon a été incubé à 37 ° C pendant 1 h, le volume du ballon a été porté à 25 ml avec du DMEM à 2% de FBS additionné de 1% de Pen / Strep et incubé jusqu’à ce que le CPE atteigne environ 90% (le temps dépend du virus). Les milieux infectés ont été récoltés, placés dans un tube conique de 50 ml et centrifugés à 2500 tr / min pendant 5 min et conservés à -80 ° C. Toutes les procédures ont été effectuées en utilisant des techniques stériles et dans une armoire de biosécurité.
2.3. Concentration virale à base de PEG et méthode de purification
Du 4G PEG préparé dans du tampon Tris-EDTA-NaCl (TEN) (poids / volume) a été préparé et ajouté au milieu infecté de manière à devenir 1X, les échantillons ont été vortexés pour homogénéisation et placés à +4 ° C sans perturbation 48 h Au bout de 48 h, le mélange PEG-CHIKV a été centrifugé à 4000 tr / min pendant 30 min. Le surnageant a été jeté et le culot a été remis en suspension dans 250 pi de TEN et stocké à -80 ° C jusqu’à utilisation ultérieure.
2.4. Caractérisation du virus par le test de la plaque
Une couche de cellules Vero dans une plaque à 96 puits (une confluence de 90% est préférable) a été préparée un jour avant l’expérience. À partir de la dilution, le virus 1: 100 a été dilué deux fois pour l’expérience. Les particules virales ont été incubées sur les cellules pendant 1 à 2 heures à 37 ° C pour permettre l’adsorption / la pénétration du virus. Ensuite, les milieux ont été retirés et les cellules ont été superposées avec 150 pi de CMC à 1% préparé dans un milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1% de pen / strep et 1% de l-glutamine (milieu de recouvrement). Les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 48 h pour le CHIKV et 3 à 5 jours pour le DENV-2. Après que les plaques aient été fixées avec du formaldéhyde à 10% pendant 30 min, lavées deux fois avec du PBS 1X et colorées avec du violet violet à 0,25% (préparé dans du méthanol à 30%) pendant 15 min. Finalement, les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS IX. Les images des plaques ont été capturées à l’aide du lecteur Elispot. Le nombre d’unités formant des plaques (pfu) dans chaque puits a été déterminé en utilisant les formules mentionnées ci-dessous.
2.5. Préparation d’extrait à l’éthanol de Nilavembu Kudineer et Andrographis
Les détails des ingrédients et leur pourcentage de présence à Nilavembu Kudineer ont été fournis en suppl. Tableau 1. Vingt-cinq grammes des constituants des plantes en poudre ont été extraits avec 100 ml d’éthanol (à 95% d’éthanol). Les contenus ont été conservés à température ambiante pendant 48 h avec une agitation constante à intervalles réguliers. Après la période d’incubation, le contenu a été filtré à travers du papier filtre Whatman N ° 1. Ensuite, les filtrats ont été séchés sous vide en utilisant un évaporateur rotatif et les concentrés ont été stockés à 4 ° C jusqu’à la fin des études pharmacologiques et biologiques.
2.6 Test de viabilité cellulaire
Le test MTT 3- (4, 5-diméthylthiazol-2-Yl) -2,5-bromure de diphényltétrazolium (Sigma, numéro de cat. D4540) a été réalisé pour évaluer la cytotoxicité du composé de kudineer Nudavembu et Andrographis extrait à l’éthanol dans des cellules Vero auparavant. protocoles standardisés [21]. En bref, des monocouches de cellules Vero ont été cultivées dans une plaque à 96 puits et ont été traitées avec différentes concentrations du composé en 8 réplicats avec un contrôle négatif (milieu contenant 0,1% de DMSO). La plaque a ensuite été incubée à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 72 h avant la réalisation de l’analyse au MTT. Trois jours après le traitement, une solution de MTT a été ajoutée aux cellules et incubée pendant 4 h à 37 ° C avec 5% de CO2 et 150 µL de DMSO ont été ajoutés avant la détection d’absorbance à 495 nm à l’aide d’un lecteur multiple. Le pourcentage de survie des cellules pour les composés a été déterminé en utilisant Graph Pad Prism 5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA, 2005).
2.7 Etudes phytochimiques et physiochimiques
2.7.1. Analyse phytochimique
Nilavembu Kudineer et Andrographis paniculata sont pris séparément pour une analyse phytochimique préliminaire. La présence de différents phytoconstituants a été détectée à l’aide des méthodes prescrites [22].
2.7.2. Évaluation organoleptique et physico-chimique
Nilavembu kudineer et Andrographis paniculata ont été soumis à la détermination de caractères organoleptiques tels que la couleur, l’odeur, le goût, la texture et des paramètres physicochimiques tels que les cendres totales, les cendres insolubles dans l’acide, les extractants solubles dans l’alcool, la perte au séchage à 105 ° C et ont été évalués méthodes standard décrites dans les textes [22].
2.8. Criblage de l’activité d’un médicament à l’aide d’essais de viabilité cellulaire in vitro
La figure 1 présente une représentation schématique des essais biologiques in vitro mis au point pour évaluer l’activité antivirale de la NVK. Dans ces essais de viabilité cellulaire, deux ensembles distincts de CHIKV et de DENV-2 ont été utilisés, dans lesquels des cellules Vero et HEK-293T ont été infectées. et les cellules Vero et les cellules THP-1 ont été infectées avec DENV-2 (MOI 1) et l’activité antivirale de Nilavembu kudineer a été testée aux concentrations indiquées. En bref, les tests ont été expliqués dans la section suivante.
Fig. 1. Représentation schématique des essais biologiques in vitro développés pour évaluer l’activité antivirale de Nilavembu Kudineer (NVK). Trois types de tests basés sur le MTT ont été conçus pour évaluer l’activité antivirale: (1) test de pré-incubation, (2) dosage de post-traitement et (3) dosage de prévention.
- Conception de tests de dépistageTrois essais biologiques ont été développés pour identifier l’activité inhibitrice du DENV / CHIKV potentielle de l’extrait à l’éthanol de NVK, comme indiqué schématiquement à la figure 1. L’analyse a été réalisée sur des types de cellules spécifiques, à savoir les cellules épithéliales de rein de singe vert (Vero) et les cellules de macrophages humains. (THP-1) pour les cellules épithéliales de rein de singe vert et africain et les cellules épithéliales de rein humain (Vero et HEK-293T respectivement) basées sur la cinétique de réplication individuelle et l’affinité pour ce type de cellule. Les cellules Vero ont servi de contrôle positif.
Le test de pré-incubation de type 1 a été conçu pour identifier la capacité de la NVK à empêcher les virus de pénétrer dans les cellules sensibles. Il a été observé que l’extrait de NVK présentait une valeur de CI50 ≤ 3,125% de la dose humaine lors du dosage de cytotoxicité. D’après les observations suivantes, on pourrait conclure que ce test avait les résultats suivants: l’extrait de NVK pouvait être cytotoxique (monocouche compromise), inactif (pas de réduction du nombre de PFU par rapport à l’infection de contrôle), ou actif (nombre réduit de FU compte). Cependant, le test de type 1 peut ne pas révéler si les extraits actifs de NVK possédaient également la capacité d’inhiber les étapes post-entrée du cycle de vie du virus.
Le test de type 2 a été conçu pour évaluer la capacité des extraits de NVK à inhiber les virus au sein de la cellule infectée. Ainsi, ce test vise à étudier l’activité de l’infection post-virale NVK. À cet égard, l’infection par le virus a précédé l’exposition à NVK. Comme la formulation polyherbal doit être intériorisée avant d’exercer un quelconque effet inhibiteur, nous avons décidé d’utiliser des quantités plus élevées d’extrait de NVK. Les résultats possibles du test de type 2 sont les suivants: une fois encore, l’extrait pourrait être cytotoxique. Sinon, il peut être inefficace pour l’une des raisons suivantes: l’extrait n’a pas pu entrer dans les cellules ou il était inefficace malgré une entrée réussie. La dernière possibilité est que l’extrait réduise le nombre de plaques, indiquant une activité antivirale potentielle.
Le test de type 3 a été conçu pour surveiller l’effet protecteur de la NVK et, à cet égard, le traitement par la NVK a précédé l’infection par le virus. Bien que le résultat possible de ce test soit également similaire aux deux autres tests, il a été utilisé pour déterminer si la NVK pouvait être utilisée dans les régions hyperendémiques au CHIKV / DENV pour contrôler les épidémies.
8.2. Méthodologie des dosages
Dans ces tests de viabilité cellulaire, des types de cellules spécifiques ont été utilisés pour étudier l’activité antivirale contre les infections à CHIKV / DENV-2; dans lequel les cellules Vero et les cellules HEK-293T ont été infectées avec les cellules CHIKV et Vero et les cellules THP-1 ont été infectées avec le DENV-2. Dans les deux cas, le virus était infecté à MOI 1 et l’activité antivirale de Nilavembu kudineer était testée aux concentrations indiquées. En bref, les tests ont été expliqués dans la section suivante.
2.8.2.1. Pré-incubation avec Nilavembu Kudineer
Les cellules Vero ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (20 000 cellules / puits) un jour à l’avance. Le CHIKV et le DENV-2 (MOI 1) ont été pré-incubés séparément avec des dilutions en série de NVK (correspondant à une concentration finale de 25 mg / mL – 12 μg / mL) dans 200 μL à 37 ° C pendant 2 h, à raison de 100 μL de ce le mélange incubé a été utilisé pour infecter les cellules en 6 plaques dans la plaque à 96 puits. Après 1 heure d’adsorption dans l’incubateur (à 37 ° C, 5% de CO2), le milieu pré-incubé a été retiré et les cellules infectées ont été complétées avec du milieu complet à 10% de DMEM dans le cas des cellules Vero et HEK-293T et du RMPI dans cas de cellules THP-1 et incubées à 37 ° C pendant 72 h. Après 72 h, les cellules ont été traitées de manière similaire au MTT, comme mentionné ci-dessus. En bref, une solution de MTT a été ajoutée aux cellules et incubée pendant 4 h à 37 ° C, après quoi 150 pi de DMSO ont été ajoutés avant la détection d’absorbance à une longueur d’onde de 495 nm en utilisant un lecteur multiplate. Pour évaluer toute cytotoxicité potentielle, les cellules ont été exposées aux formulations de NVK (dans le même intervalle de concentration) en l’absence d’infection par CHIKV. Des expériences de contrôle supplémentaires, menées en parallèle, incluaient des cellules qui étaient soit infectées de manière fictive (contrôle négatif), soit infectées par CHIKV / DENV-2 en l’absence de NVK. La concentration inhibitrice demi-maximale (valeur IC50) pour chaque concentration de NVK par rapport au CHIKV / DENV-2 a été calculée, par référence au témoin positif représentant un taux de survie de 100%. Le pourcentage de survie des cellules pour le composé a été déterminé = en utilisant GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA, 2005).
2.8.2.2. Post-traitement après infection par Nilavembu Kudineer
Des cellules Vero dans des plaques à 96 puits (20 000 cellules / puits) ont été infectées avec CHIKV / DENV-2 (MOI 1) pendant 1 h. Après l’adsorption du virus, l’inoculum du virus a été aspiré et alimenté avec du milieu complet contenant de la NVK aux concentrations indiquées ci-dessus. Après 2 h de traitement, le milieu contenant de la NVK a été aspiré et remplacé par du milieu DMEM complet à 10% dans le cas des cellules Vero et HEK-293T et du RPMI dans le cas des cellules THP-1. En outre, l’essai a abouti de la même manière que celle mentionnée dans l’essai 1.
2.8.2.3. Effet préventif de Nilavembu Kudineer
Des cellules Vero dans des plaques à 96 puits (20 000 cellules / puits) ont été traitées avec différentes concentrations de NVK pendant 2 h à 37 ° C. Après le traitement, le milieu NVK a été aspiré et les cellules ont été infectées avec CHIKV / DENV-2 (MOI 1) pendant une heure à 37 ° C. Après l’infection, le milieu viral a été aspiré et remplacé par 10% de milieu DMEM complet dans le cas des cellules Vero et HEK-293T et du RPMI dans le cas des cellules THP-1. En outre, l’essai a abouti de la même manière que celle mentionnée dans l’essai 1.
3. Résultats
3.1. Caractérisation du virus
Le nombre d’unités de formation de plaque du virus CHIKV et DENV-2 amplifié en laboratoire a été effectué en utilisant le test de plaque comme mentionné ci-dessus, il a été observé que la PFU de CHIKV et de DENV-2 était respectivement de 1×109 PFU / mL et de 1×108 PFU / mL. Le gène d’enveloppe du DENV et le gène El du CHIKV ont été séquences. Nous avons observé que l’enveloppe de DENV appartenait au sérotype DENV-2 et que le gène E1 de CHIKV appartenait au génotype East / Central / South Africa (ECSA) (données non présentées).
3.2. Activité phytochimique et physico-chimique préliminaire de Nilavembu Kudineer
Les études physicochimiques sur les cendres totales, les cendres hydrosolubles, les cendres insolubles dans l’acide, le pH et la nature extractive de la poudre de Nilavembu Kudineer ont été effectuées et les résultats sont documentés dans Suppl. Tableau 2. La couleur de l’extrait à l’éthanol de Nilavembu Kudineer est brun foncé et celle d’Andrographis est vert foncé. Le criblage phytochimique de tous les extraits de la formulation de Nilavembu Kudineer a également été effectué et les résultats ont montré la présence de terpénoïdes, d’alcaloïdes, de glucides, de tanins et de stéroïdes (voir tableau 3) en tant que composants principaux.
3.3. Test de cytotoxicité cellulaire pour Nilavembu kudineer et Andrographis
Un test au MTT a été réalisé pour évaluer la cytotoxicité de l’extrait à l’éthanol de NVK ainsi que d’Andrographis. Il a été observé que la NVK était non toxique à partir de 3,1% de la dose humaine (soit environ 1,8 mg / ml) et qu’Andrographis présentait un taux de mortalité des cellules supérieur à 80% à cette concentration (figure 2). Il a été observé qu’Andrographis présentait une toxicité supérieure à celle de NVK pour toutes les concentrations indiquées au cours de l’étude. Seulement 12 µg / mL d’Andrographis ont présenté moins de 20% de mort cellulaire par rapport à aucune en cas de NVK. Ainsi, il est conclu qu’Andrographis était extrêmement cytotoxique s’il était administré individuellement, mais que sa toxicité diminuait considérablement lorsqu’il était administré sous forme de formulation polyherbal sous le nom de NVK. Sur la base de ces observations, d’autres études ont été menées uniquement sur NVK. L’activité antivirale de la NVK à partir de 3,1% de la dose humaine a été considérée comme significative (à ces concentrations, la NVK a montré moins de 20% de mort cellulaire).
Fig. 2. Essai de cytotoxicité pour NVK et Andrographis: Un essai de cytotoxicité à base de MTT a été réalisé pour évaluer la cytotoxicité cellulaire d’extrait à l’éthanol de NVK et Andrographis à partir de 50% de la dose humaine. Andrographis s’est avéré plus cytotoxique que NVK à des concentrations variables.
3.4. Criblage in vitro de Nilavembu Kudineer pour le traitement de l’infection à DENV-2
Les trois types d’essais ont été réalisés dans des cellules Vero et THP-1, afin de déterminer l’activité antivirale de NVK contre l’infection par le virus DENV-2 (figure 3). Il a été observé que, dans le cas d’une lignée cellulaire de macrophages humains (THP-1), la NVK présentait une activité antivirale significative dans le test de type 1 de 0,78% à 0,01% de la dose humaine. La formulation fonctionnait mieux à 0,05% de la dose humaine, après quoi l’activité de la formulation diminuait de manière dose-dépendante (l’activité diminuait avec l’augmentation de la dose) de 0,1% à 0,78% de la dose humaine. En cas de dosage de type 2, NVK n’a montré aucun effet post-traitement contre l’infection par DENV-2. En cas de dosage de type 3, un effet protecteur significatif de la NVK a été observé à une concentration de 0,1 à 0,10% de la dose chez l’homme. L’activité maximale de la formulation a été observée à 0,1% de la dose humaine. Lorsque des expériences similaires ont été effectuées pour les cellules épithéliales, il a été observé que la NVK n’était pas incapable de présenter une activité antivirale contre l’infection par le DENV-2. En résumé, on pourrait résumer que NVK est capable d’une activité antivirale spécifique à un organe et qu’elle peut être utilisée comme antiviral potentiel contre le DENV-2, à la fois comme mesure préventive avant l’infection et comme antiviral lors d’une infection active. L’efficacité de la NVK sur les lignées cellulaires THP-1 permet de mieux comprendre l’effet immuno-modulateur potentiel de la NVK.
Fig. 3. Évaluation de l’activité antivirale de NVK après infection par DENV-2. L’activité antivirale de NVK a été évaluée sur la base des trois types d’essais à base de MTT conçus pour l’étude. Lors de l’infection par DENV-2, il a été observé que NVK présentait une activité antivirale comme agent prophylactique ainsi que pendant l’infection active. * indique une valeur p <0,05 et ** indique une valeur p <0,01.
3.5. Criblage in vitro de Nilavembu Kudineer pour le traitement de l’infection à CHIKV
Les trois types d’essais ont été réalisés dans une lignée de cellules épithéliales de rein de mammifère, à savoir des lignées cellulaires de rein épithéliales de Vero et humaines, à savoir HEK-293T, afin de déterminer l’activité antivirale de NVK contre l’infection par le virus CHIKV (figure 4). Il a été observé que, dans le cas de Vero, NVK ne présentait aucune activité antivirale pour les dosages de types 1 et 2, alors que dans le cas du test de type 3, NVK présentait une activité antivirale significative de 0,01% à 3,13% du virus humain. dosage en avant. Les résultats ont démontré l’effet protecteur de la NVK dans le cas des cellules Vero. Lorsque des expériences similaires ont été effectuées dans des cellules HEK-293T, il a été observé que, dans le cas du test de type 1, NVK présentait une activité antivirale à 3,13% et 1,56% de la dose humaine. En revanche, aucune activité antivirale de la NVK n’a été observée dans les dosages de type 2 et de type 3. En résumé, on pourrait résumer que NVK pourrait être utilisé à la fois comme agent protecteur et pendant les infections à CHIKV actif. Ces résultats ont également démontré l’importance du choix des cellules en fonction de la susceptibilité cellulaire du virus à effectuer les tests.
Fig. 4. Evaluation de l’activité antivirale de NVK lors d’une infection à CHIKV. L’activité antivirale de NVK a été évaluée sur la base des trois types d’essais à base de MTT conçus pour l’étude. Il a été observé que lors de l’infection à CHIKV, NVK présentait une activité antivirale qui agissait comme un agent prophylactique ainsi que pendant l’infection active. * indique une valeur p <0,05 et ** indique une valeur p <0,01.
Dans nos tests, NVK a présenté des effets radicalement différents dans les lignées de cellules épithéliales de rein de singe et de rein humain en fonction de la susceptibilité cellulaire du CHIKV à ces cellules.
4. Discussion
Les FC et les FD posent de graves problèmes de santé publique en Inde. Bien que la lutte antivectorielle soit la méthode la plus efficace pour lutter contre ces deux infections, la principale préoccupation en matière de lutte contre les infections est l’absence de médicaments ou de vaccins appropriés. Après une épidémie majeure de FK en 2006, le département d’AYUSH a étudié l’effet des médicaments à base de siddha sur les patients atteints de FK à divers endroits dans le sud du sous-continent indien et a recommandé un schéma thérapeutique spécifique pour la gestion de la maladie [10]. Dans tous ces schémas thérapeutiques, il a été observé que 95% des patients recrutés pour l’étude présentaient une réponse positive au schéma thérapeutique. Par la suite, tous les schémas thérapeutiques ont été complétés par l’utilisation de NVK à la fois dans la phase pyrexique et post-pyrexique de la maladie, en raison de son rôle précédemment connu dans la modulation de l’immunité avec les autres formulations à base de plantes siddha et minéro-plantes. Plusieurs études antérieures ont étudié l’impact de la NVK sur diverses activités pour ses activités antipyrétique, analgésique et anti-inflammatoire. Il est connu pour conférer une protection à différentes doses dans différents modèles expérimentaux [18], [23].
Différentes méthodes d’extraction ont montré des résultats de formulation dans plusieurs formulations à base de plantes [24], [25]. Un facteur principal contribuant à ces différences de réponse réside dans la caractéristique inhérente des composés chimiques dans ces formulations. Il est connu que les formulations de polyherbal ont une solubilité variable dans différents solvants, qui est déterminée par la structure des composés phénoliques qu’ils contiennent, ce qui peut contribuer à déterminer le rendement final en polyphénols à partir de substances végétales [26], [27]. Un article récent de notre laboratoire a montré que les extraits aqueux de NVK ne présentaient aucune activité antivirale lors d’une infection à CHIKV dans des conditions in vitro [28], alors que le rapport actuel démontre clairement l’activité antivirale des extraits à l’éthanol de NVK.
De plus, nous avons observé que l’addition d’additifs au composant actif est très importante pour réduire sa cytotoxicité et le rendre disponible pour la consommation humaine. Andrographis, le composant actif connu de la NVK, est hautement cytotoxique dans des conditions in vitro, ce qui peut entraîner des risques graves pour la voie orale lorsqu’il est consommé seul. Norma G. Cuellar [29] a abordé une question similaire dans laquelle il a été rapporté que l’importance des médicaments à base de plantes réside dans le fait qu’ils utilisent des plantes dans leur ensemble, ce qui est un point important, car si les concepts modernes sont utilisés en médecine alternative et seul le composant actif est séparé, alors cessera d’agir en tant que médicament à base de plantes et agira clairement en tant que médicament chimique pouvant être hautement toxique / dangereux pour le corps humain et, par conséquent, il convient d’éviter cette approche de la science moderne pendant le travail sur le système de médecine alternative.
Enfin, cette étude s’est concentrée sur les différences observées dans l’activité antivirale de NVK lors d’infection par CHIKV et DENV dans des lignées cellulaires spécifiques d’organes. Des études antérieures ont montré que CHIKV et DENV agissent de manière spécifique à un organe [30], [31], [32]. Le rôle de NVK dans un régime pendant la FK et la DF a été étudié de manière approfondie par la communauté siddha chez les patients de divers centres siddha, en tenant compte des principaux symptômes de la maladie [10], [16]. Gardant ces deux points à l’esprit, nous avons utilisé des lignées cellulaires spécifiques d’organes pour étudier le rôle antiviral de NVK dans les infections par CHIKV et DENV. Nos données montrent clairement que le temps du traitement de la toxicomanie est important pour obtenir une réponse antivirale maximale. La condition idéale serait de démontrer les effets du médicament sur un modèle animal approprié; Cependant, le manque de modèles animaux appropriés pour étudier ces virus est un obstacle pour répondre à certaines des préoccupations mécanistes.
- ConclusionLa présente étude a permis de mieux comprendre le mode d’action de la NVK en tant qu’agent antiviral dans la lutte contre la FK et la DF. Compte tenu de l’impact considérable de ces deux infections sur la santé publique en Inde, les informations de la présente étude pourraient être utilisées pour élaborer des stratégies efficaces de lutte contre la maladie en utilisant NVK pour la prophylaxie en cas d’épidémie.
Source de financementCe travail a été financé par le ministère de l’Ayurveda, du Yoga, de l’Unani, du Siddha et de l’homéopathie (AYUSH), gouvernement de l’Inde, [numéro de subvention: ND / AYU / 15/019].
Les conflits d’intérêtsLes auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.
Annexe A. Données supplémentairesVoici les données supplémentaires à cet article:
Research data for this article
Data not available / No data was used for the research described in the article
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